Rekombinasi Gen

KEDELAI

•   Kedelai dapat dikonsumsi secara langsung maupun juga dapat diolah menjadi tempe,tahu, tauco, kecap, susu kedelai, dsb

•   Salah satu masalah utama yang dihadapi petani dalam budidaya kedelai adalah ganguan hama penggerek  (Etiella zinkenella) 

Bagaimana cara bijak menghadapi serangan hama penggerek ?

Selain dengan pengendalian hama secara hayati. Secara bersamaan para ilmuwan juga terus menciptakan teknik-teknik rekayasa genetika yang melibatkan DNA rekombinan agar memperoleh varietas kedelai unggul  yang resisten terhadap hama penggerek. Tanaman kedelai hasil  DNA rekombinan ini dikenal dengan kedelai transgenik.

Apakah DNA REKOMBINAN ITU?

Teknik DNA rekombinan merupakan rekayasa genetika untuk  menghasilkan sifat baru dengan cara merekombinasikan gen tertentu dengan DNA genom.

Tanaman kedelai dengan sifat yang diinginkan dapat terjadi  misalnya dengan mentransformasikan gen gus. Varietas yang akan digunakan contohnya varietas wilis dan tidar. Vektor transformasi yang dgunakan adalah Agrobacterium tumefaciens  dengan mengisolasi gen dari bakteri Bacillus thuringiensis (Bt).

Bagaiamana prosesnya?

TAHAP PERSIAPAN DAN TANSFORMASI GEN GUS

1. Menanam benih kedelai willis dan Tidar di rumah kaca terlebih dahulu.
2. Mengambil polong panen saat berumur 14/15 hari
3. Mencuci bersih polong dengan air sabun dan membilas dengan air bersih
4. Merendam polong dengan akuades streil 3-4 kali
5. Eksplan kotiledon dan embrio muda diisolasi dari polong  streril
6. Sebelum inokulasi, eksplan diperlakukan dalam media cairan bakteri dan medium luria bertai perbandingan 1:1 selama 24 jam
7. Kemudian baru dimasukan ke suspensi medium MS (Murashige dan Skoog 1962) + 100 mM sukrosa + 200 M asetosiringon, pH 5,7

8. Proses inokulasi menggunakan  strain Agrobacterium tumefaciens EHA 105 denganplasmid pCambia 1301 yang mengandung gen gus dan php. Selama 60 dan 90 menit
9. Pengujian ekspresi gen gus pada eksplan hasil inokulasi Agrobacterium tumefaciens . Semakin banyak dan tebal warna biru, makin tinggi ekspresi gen gus

TRANSFORMASI DENGAN GEN pinII

1. Eksplan kotiledon muda willis dan tidar diinokulasi dengan Agrobacterium tumwfaciens  strain pGApinII (membawa gen pinII dan npt) selama 90 menit
2. Eksplan yang telah diinokulasi dikeringkan dengan cawan petri yang telah diberi alas kertas kering saring steril, selanjutnya dipindahkan ke media kokultivasi  (MS + vitamin B + asetosiringon 20 mM)
3. Eksplan dicuci dengan larutan cefotaxime 200 mg/l, lalu dikulturkan pada media seleksi I yang terdiri dari medium MS + vitamin B5 + NAA 10 mg/l + L-glutamin 30 mg/l +L-asparagin 30 mg.l + sukrosa 5 mg/l ditambah kanamisin 200 mg/l. pada 4-6 minggu kemudian, eksplan yang tumbuh dan mengalami embryogenesis dipindahkan ke medium seleksi I_1-1, yaitu medium I, dengan kadar NAA 1 mg/l + kanamisin 200 mg/l. Embrio somatik yang telah dewasa sempurna dikecambahkan pada medium G0₁ (MS + vitamin B5 + GA₃ 0,1 mg/l). Plantet yang dihasilkan dipindahkan ke medium ½ MS + vitamin B5 + IBA 1 mg untuk inisiasi perakaran selama 2-3 minggu, kemudian diaklimatisasi ke media tanah dalam pot.

Analisis molekuler tanaman hasil transformasi

Sampel DNA hasil isolasi dari daun muda sebanyak 4 µ1 dimasukan ke dalam tabung PCR 0,5 ml, kemudian ditambahkan 2,5 µ1 10 x buffer PCR (Promega), 2 µ1 campuran dNTPs (2,5 mM setiap dNTPs, Promega), 1 µ1 masing-masing primer untuk pinII , 10,33 µ1 ddH2O dan 0,175 µ1 Taq polymerase (total volume 25 µ1). Tabung sampel ditambah satu tetes minyak mineral lalu ditutup dengan selotip tahan panas.

Program PCR melalui beberapa tahap, yaitu.

1. Tahap inisiasi denaturasi pada 94⁰C selama 5 menit
2. Tahap denaturasi pada 94⁰C selama satu menit
3. Tahap annealing  pada 55⁰ C selama satu menit
4. Tahap keempat pemanjangan  selama satu menit pada suhu 72⁰C

Tahap 2-4 diulang. 35 kali. Lalu dilanjutkan tahap 5, yaitu inkubasi pada  suhu 72⁰C selama 5 menit. 

Produk PCR di-loadning pada 1 % agarose gel yang mengandung ethidium bromide bersamaan dengan sampel DNA tanaman kontrol dan DNA standar (gen pinII). Gel hasil elektroforesis divisualisasi dengan UV dan difoto dengan film Polaroid. Data berupa pita-pita DNA dianalisis berdasarkan ada tidaknya pinII sebesar 600 bp.

Pengujian dilakukan dengan metode infestasi langsung (in vitro) larva umur satu hari (neonate). Tanaman yang diuji adalah kedelai keturunan pertama dari event AT₁. Tiga puluh benih kedelai AT₁R₁ dan Tidar nontransgenik sebagai kontrol ditanam dalam pot dan dipelihara di rumah kaca. Setelah tanaman mulai berpolong (50) hari), setiap tanaman dipilih 10 polong yang berbeda tempatnya, lalu setiap polong diinfestasi dengan 3 ekor larva Etiella zinkenella. Selanjutnya polong ditutup dengan kantung pastik berlubang untuk mengisolasi larva. Pengamatan dilakukan setelah tanaman dipanen untuk mengetahui presentase serangan larva pada polong dan biji. Pengelompokan criteria ketahanan tanaman kedelai terhadap hama penggerek polong mengacu pada hasil penelitian Akib dan Baco (1985) dalam (Jurnal Bioteknologi Pertanian, Vol.9, No.1, 2004, pp. 22) sebagai berikut. Tanaman tahan jika serangan polong 0-10 %, agak tahan 11-30 %, agak peka 31-50 %, peka 51-70 %, dan sangat peka 71-100 %.

Mekanisme Rekombinasi Genetik

Gambar Eksplan

Serangga dari ordo Lepidoptera bergantung pada serine proteinase (tripsin, kemotripsin, dan estalase). Enzim proteinase mengkatalisis pemecahan protein yang dimakan oleh serangga untuk mendapatkan asam amino yang penting bagi perumbuhan normal serangga. Proteinase inhibitor II  (pinII) merupakan salah satu contoh senyawa penghambat (inhibitor) kerja enzim serine proteinase khususnya tripsin dan kimotripsin dari serangga Lepidoptera. Jika gen pinII berhasil ditransfer ke dalam kromosom tanaman dan mampu diekspresikan, maka serangga yang memakan bagian dari tanaman transgenic tersebut akan terganggu sistem pencernaannya, terhambat perumbuhannya, dan akhirnya mati jika tingkat penghambatan pencernaan protein relatif tinggi.